Using human pluripotent stem cells derived skeletal muscles to address the pathogenesis of recessive limb girdle muscular dystrophy type R2
Utilisation des cellules souches pluripotentes humaines pour modéliser les mécanismes physiopathologiques associés aux dystrophies musculaires des ceintures de type R2
Résumé
Limb Girdle Muscular Dystrophies (LGMD) refer to a genetically heterogeneous group of autosomal inherited muscular dystrophies characterized by a progressive muscle weakness and wasting of the shoulder or pelvic girdles. Among them, LGMD R2 (or formerly LGMD 2B) is caused by mutations in the DYSF gene leading to a deficiency of dysferlin, a protein essential to skeletal muscle physiology. Since the identification of the genetic cause underlying LGMD R2 in 1998, major advances in diagnosis, pathophysiological understanding and development of therapeutic strategies have been performed. Nevertheless, no curative treatment is currently available for patients, highlighting the need to decipher the molecular mechanisms associated to LGMD R2. In this context, the first objective of my thesis was to set up the experimental conditions allowing the production of skeletal muscle cells from human induced pluripotent stem cells (hiPSC) and to evaluate the potential of this cellular model to model LGMD. Thanks to a robust myogenic differentiation protocol, I generated homogeneous and functional populations of myoblasts and myotubes expressing the majority of genes and proteins involved in LGMD, and demonstrated the reliability of this cellular model to recapitulate the phenotypes associated to the LGMG R9 subtype.Once this new cellular model was characterized, the second objective of my thesis was to identify new molecular pathways regulated by dysferlin. Using a transcriptomic approach, I identified in hiPSC-derived myotubes from LGMD R2 patients a deregulation of the expression level of Disabled-2 (Dab2), an adaptor of clathrin mediated endocytosis. Overall, the results demonstrate that Dab2 is inversely regulated by dysferlin levels. Because Dab2 is involved in the regulation of low-density lipoprotein receptor (LDLr) internalization and cholesterol-rich LDL uptake, we then hypothesized that its deregulation might be involved in the pathophysiology of LGMD R2, and more specifically in the defective cholesterol homeostasis in patients. Beyond the study of this fundamental molecular process of cholesterol endocytosis, this project could open a new therapeutic avenue for the treatment of LGMD R2 by modulating cholesterol homeostasis using new genetic tools or readily available pharmacology.In parallel, I developed during my thesis another project aiming at pharmacologically preventing the degradation of misfolded but functional forms of dysferlin. This is the case of the L1341P missense mutation of dysferlin which leads to misfolding of the protein, its aggregation in the endoplasmic reticulum and its subsequent degradation by the ERAD (endoplasmic reticulum-associated protein degradation machinery). In this translational research program, the effect of 2239 repositionable drugs was evaluated on the expression and localization of this dysferlin variant, leading to the identification of two autophagy inducers, saracatinib and bazedoxifene, as drug candidates. Beyond identifying a new therapeutic option for LGMD R2 patients, our results highlight a reusable procedure to evaluate the effect of thousands of repurposable drugs on similar muscle disorders caused by ERAD degraded missense mutations.
Les dystrophies musculaires des ceintures (ou LGMD pour Limb Girdle Muscular Dystrophies) désignent un ensemble de maladies génétiques rares caractérisées par une atrophie et une faiblesse spécifique des muscles squelettiques du bassin (ceinture pelvienne) et des épaules (ceinture scapulaire). Parmi la trentaine de formes de LGMD identifiées, la LGMD R2 (ou anciennement LGMD 2B) est causée par une déficience en dysferline, due à des mutations du gène DYSF, qui est une protéine essentielle à la physiologie des muscles squelettiques. Depuis l'identification de la cause génétique sous-jacente à la LGMD R2 en 1998, des avancées majeures en termes de diagnostic, de compréhension physiopathologique et de développement de stratégies thérapeutiques ont été réalisées. Néanmoins, il n'existe à ce jour aucun traitement thérapeutique disponible sur le marché pour les patients, soulignant la nécessité d'avoir une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la LGMD R2.Dans ce contexte, le premier objectif de ma thèse consistait à mettre en place les conditions expérimentales permettant la production de cellules musculaires squelettiques à partir de cellules souches humaines induites à la pluripotence (hiPSC) et à évaluer le potentiel de ce modèle cellulaire pour modéliser les LGMD. Grâce à un protocole robuste de différenciation myogénique, j'ai ainsi pu générer des populations homogènes et fonctionnelles de myoblastes et de myotubes exprimant la majorité des gènes et des protéines impliqués dans les LGMD et démontrer la fiabilité de ce modèle cellulaire à récapituler les phénotypes spécifiques à une LGMD, la LGMD R9.Une fois ce nouveau modèle cellulaire caractérisé, le second objectif de ma thèse était d'identifier de nouvelles voies moléculaires régulées par la dysferline. Par une approche transcriptomique, j'ai ainsi identifié dans les myotubes dérivés de hiPSC de patients LGMD R2 une dérégulation du niveau d'expression de Disabled-2 (Dab2), un adaptateur de l'endocytose médiée par les clathrines. Dans l'ensemble, les résultats démontrent que Dab2 est inversement régulé par les niveaux de dysferline. Dab2 étant impliqué dans la régulation de l'internalisation du récepteur aux lipoprotéines de faible densité (LDLr) et de l'absorption des LDL riches en cholestérol, nous avons alors émis l'hypothèse que sa dérégulation pourrait être impliquée dans la physiopathologie de la LGMD R2, et plus particulièrement dans l'homéostasie défectueuse du cholestérol chez les patients. Au-delà de l'étude de ce processus moléculaire fondamental d'endocytose du cholestérol, ce projet pourrait ouvrir une nouvelle voie thérapeutique pour le traitement de la LGMD R2 en modulant l'homéostasie du cholestérol à l'aide de nouveaux outils génétiques ou d'une pharmacologie facilement accessible. En parallèle, au cours de ma thèse, j'ai développé un autre projet visant à empêcher pharmacologiquement la dégradation des formes mal conformées mais fonctionnelles de la dysferline. C'est notamment le cas de la mutation faux-sens L1341P de la dysferline qui conduit à un mauvais repliement de la protéine, son agrégation dans le réticulum endoplasmique et sa dégradation ultérieure par l'ERAD (endoplasmic reticulum-associated protein degradation machinery). Dans ce programme de recherche translationnel, l'effet de 2239 médicaments repositionnables a été évalué sur l'expression et la localisation de ce variant de la dysferline, aboutissant à l'identification de deux inducteurs d'autophagie, le saracatinib et le bazédoxifène comme médicaments candidats. Au-delà de l'identification d'une nouvelle option thérapeutique pour les patients atteints de LGMD R2, nos résultats mettent en lumière une procédure réutilisable pour évaluer l'effet de milliers de médicaments repositionnables sur des troubles musculaires similaires causés par des mutations faux-sens dégradées par l'ERAD.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
|---|